器官形成開始時のマウス胚全体の時空間トランスクリプトームマップ

Nature Genetics volume 55、pages 1176–1185 (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

遺伝子発現の時空間的な調整は、適切な胚発生のために必要です。単一細胞技術の使用により、マウスの胚形成中のほとんどの細胞状態の詳細な分子定義を含む、初期の制御ダイナミクスの解像度が向上し始めています。ここでは、Slide-seq を使用して、完全な胚日 (E) 8.5 および E9.0、および部分的な E9.5 胚の空間トランスクリプトームマップを構築しました。それらの有用性をサポートするために、私たちは、局所的な遺伝子発現パターンの定量的調査を可能にする、三次元「仮想胚」を再構成および探索するためのツールである sc3D を開発しました。発生中の神経管の胚主軸に沿った我々の測定により、これまで注釈が付けられていなかった、異なる空間パターンを持ついくつかの遺伝子が明らかになりました。我々はまた、Tbx6 変異体胚で出現する「異所性」神経管の矛盾する転写的同一性を特徴付けました。まとめると、我々は、胚全体の構造と変異表現型の時空間研究のための実験的および計算的枠組みを提示します。

胚の発生には、多数の分子、細胞、組織レベルのプロセスの正確なタイミングと位置が必要です1、2、3、4、5。これらのイベントは、細胞型の指定、移動、および局在化を調整する遺伝子発現の時空間制御を介して指示されます6、7、8、9。この制御が崩れると、多くの場合、胎児の致死性や発育異常が引き起こされます5、10、11。原腸形成の終わりと器官形成の開始（胎生日 (E) 8.5 ～ 9.5）で、組織は適切な構造と機能を保証するために、心臓のループ形成、脳の区画化、神経管の折り畳みなどの大きな形態学的変化を経験します 12,13,14。神経形成を通じて、神経板の上皮細胞は折りたたまれて形態学的に規定された管を形成し、その背腹（DV）軸に沿って層状の遺伝子発現サインを示します。これは、その後のニューロンサブタイプの多様化に必要です15、16、17、18、19、20。、21。このプロセスに関与する多くの遺伝子が特定されていますが、これらのパターンを支配する正確な遺伝子制御ネットワークはまだ研究中です。最近の単細胞研究は、運命特定のトポグラフィーについてのより深い理解を提供し始めており、これらの細胞状態遷移の根底にあるいくつかの分子機構を浮き彫りにしている 22,23,24,25,26,27,28。解離ベースのアプローチの限界の 1 つは、組織構造を保存できないことであり、ネイティブのコンテキスト内での発現解析が不可能になります。空間トランスクリプトーム技術の最近の進歩は、成体組織および発生中の胚内の細胞型の組織化を調査することを目的として、このギャップを埋め始めています29、30、31、32、33、34、35、36、37、38。

この研究では、10 µm の空間分解能でトランスクリプトーム全体の遺伝子発現データを生成する技術である Slide-seq を使用して、マウスの初期器官形成中の胚全体のマップを構築しました。私たちのデータにより、空間的な遺伝子発現パターン、細胞状態分布の探索、「仮想」遺伝子発現解析および変異表現型の解剖のための三次元 (3D) トランスクリプトームマップの再構築が可能になりました。私たちは特にデータを活用して、神経管の形成とパターン形成に焦点を当て、宇宙における局所的な遺伝子発現と分化の軌跡を特定しました。全体として、当社は、発生中のマウス胚における遺伝子発現パターンを調査するための、包括的な高解像度の空間アトラスと、アクセスしやすくすぐに使用できるビジュアライザーを提供します。

初期器官形成中の細胞のアイデンティティを空間的にマッピングするために、2つの代表的なE8.5胚、1つのE9.0胚、および3つの部分的なE9.5胚に対してSlide-seqを使用しました（図1aおよび拡張データ図1a）。 2 つの E8.5 胚について、約 30 μm の間隔で、それぞれ 15 個と 17 個の矢状断面 (厚さ 10 μm) を取得しました。 E9.0胚の場合は20μm間隔の26枚の矢状切片、3つのE9.5胚の場合は正中線から13枚のスライスが得られました（図1aおよび補足表1）。合計で、ビーズあたり 1,798 個の転写産物と 1,224 個の遺伝子の中央値を持つ 533,116 個の高品質ビーズを回収しました (拡張データ図 1b–d)。各ビーズに割り当てられた細胞状態を確認するために、事前に生成された単一細胞参照にビーズを計算的にマッピングしました (拡張データ図 1e、f)26。この情報を使用して、配列決定された各ビーズから (1) 空間座標、(2) 関連する遺伝子発現プロファイル、および (3) 細胞状態の割り当てを抽出しました。全体として、細胞状態の良好な整列と、とりわけ Ttn (心臓)、T (尾芽)、Meox1 (体節)、Sox2 (神経管、脳) などのマーカー遺伝子の空間的制限が観察されました (拡張データ図 2a)。 -e)。さらに、複製間で同等の胚組成と遺伝子発現パターンを回収する際の高い再現性が観察されました（拡張データ図2c-f）。

5 embryos per experiment, and consistently yielded the same phenotype. The Slide-seq experiment was performed on one representative transversal section for WT and two for KO embryos. b, Spatial grid map showing the organization of neural tube 1, 2 and somitic cells in WT and Tbx6 KO embryos. c, UMAP showing the projection of cells assigned to the indicated clusters on the trunk trajectory (Fig. 3c), with the size of the dots representing the degree of uncertainty of mapping to the respective position. d, Dot plot showing the expression of the indicated genes in the three clusters (dot size is percentage of cells per cluster; color is cluster average normalized expression). e, RNA–FISH of the indicated genes in a transversal section of an E9.5 WT and KO embryos. The dotted lines in the schematic denote the AP position within the trunk from which sections were obtained. A representative section from WT and KO embryos at E9.5 is shown. The expression pattern was verified in two of the KO experiments with n > 3 embryos per experiment. Scale bars, 50 µm. f, Schematic showing the transcriptional identity and patterning characteristic of the ectopic neural tubes that arise in the absence of Tbx6 expression, highlighting their conflicting transcriptional identity./p>

0.2; Two-sided Wilcoxon ran sum test). e. Schematic and spatial expression plot distinguishing dorsal and ventral diencephalon/midbrain regions. Shh marks the ventral domain, whereas Fzd10 (Wnt receptor) marks the dorsal part. Each dot represents a bead. The color scale depicts normalized gene expression. Scale bar, 100 µm. D, dorsal; V, ventral; R, rostral; C, caudal./p>0.05 then ranked by FDR). A selected set of previously known genes associated with dorsoventral patterning (black) are highlighted on the right. Specific structures along the axis are highlighted at the bottom of the heatmap. Genes are row z-score normalized and listed in Supplementary Table 7. b. Heatmap showing column scaled z-score of Pearson correlation coefficients comparing the Slide-seq dorsoventral bins and the identified clusters from a neural tube single-cell reference26. RP, roof plate; dp, dorsal progenitors; pMN, motor neuron progenitors; FP, floor plate. c. Heatmap showing an extended subset of the genes that display gene expression regionalization in one of the eight generated bins along the dorsoventral axis (genes filtered by FDR < 0.01 and logFC>0.05 then ranked by FDR). Specific structures along the axis are highlighted at the bottom of the heatmap. Genes are row z-score normalized and listed in Supplementary Table 7. d. Pie chart displaying differentially expressed genes along the dorsoventral axis divided by cellular and molecular function. Genes are listed in Supplementary Table 7. e. Schematic (top panel) and spatial gene expression plots of the known neural tube patterning genes in array E9.5_2. Each dot denotes a bead. The color scale depicts normalized gene expression. D, dorsal; V, ventral; A, anterior; P, posterior. f. RNA-FISH and Slide-seq quantifications for each profiled gene from Fig. 4e. Genes are bin z-score normalized (magenta: RNA-FISH; orange: Slide-seq). D, dorsal; V, ventral./p>