新規抗原 | 天津流量計株式会社

Nature volume 610、pages 752–760 (2022)この記事を引用

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メトリクスの詳細

自己抗原または無害な外来抗原に対する耐性を確立し維持することは、生物の健康を維持するために不可欠です。胸腺内では、自己免疫制御因子 (AIRE) を発現する胸腺髄質上皮細胞 (mTEC) が、自己反応性 T 細胞の欠失と胸腺制御性 T (Treg) 細胞の発生促進を通じて自己寛容に重要な役割を果たしています 1,2,3,4。生後数週間以内に、食事や共生微生物叢に由来する抗原に曝露されると、末梢では Treg 細胞分化の別の波が発生します 5,6,7,8 が、末梢 Treg (pTreg) 細胞の生成に関与する細胞タイプは特定されていない。今回我々は、mTECと樹状細胞の両方の転写特徴を備え、4つの主要なサブグループ（TC I〜TC IV）を含む、Thetis細胞と呼ばれるRORγt+抗原提示細胞のクラスの同定について説明します。われわれは、pTreg細胞の分化の波と一致する、人生初期の重要な時期に腸リンパ節内でテティス細胞の発生の波が存在することを明らかにした。 TC I および TC III は特徴的な mTEC 核因子 AIRE を発現しましたが、TC IV は AIRE 発現を欠き、TGF-β 活性化インテグリン αvβ8 などの pTreg 生成に必要な分子が豊富でした。 Thetis 細胞による主要組織適合性複合体クラス II (MHCII) または ITGB8 のいずれかの喪失は、腸の pTreg 分化に重大な障害をもたらし、その後の大腸炎を引き起こしました。対照的に、RORγt+ グループ 3 自然リンパ球 (ILC3) および古典的樹状細胞による MHCII 発現は、pTreg 生成に十分でも必要でもなかったことから、TC IV が初期の生命期に必須の機能を持つ寛容原性 RORγt+ 抗原提示細胞であることがさらに示唆されました。私たちの研究は、胸腺と末梢における自己抗原と外来抗原に対する寛容を確立するための並行経路を明らかにしており、これは共通の細胞プログラムと転写プログラムの関与を特徴としています。

胸腺では、上皮細胞の異なる系統が、自己反応性 T 細胞の欠失と Treg 細胞の分化促進を通じて自己抗原に対する寛容を確立します 1、2、3、4。 mTEC のこれらの機能は、組織限定抗原の異所性発現を制御する AIRE の発現によって部分的に媒介されます 1。寛容誘導のもう 1 つの主要な部位は腸リンパ組織内にあり、乳児の発達中の免疫系は離乳時に多くの新しい食事成分や定着微生物にさらされます。この幼少期の発達期に調和のとれた宿主と微生物叢の関係を確立することは、後の免疫介在性疾患の発症を防ぐために重要です7,9。腸内微生物に対する寛容の確立の中心となるのは、共生生物由来の抗原との遭遇により、ナイーブ T 細胞が末梢で生成された Treg (pTreg) 細胞に分化することです 5、6、10、11。しかし、pTreg 細胞の分化を促進する抗原提示細胞 (APC) の正体は不明です。腸の免疫恒常性を確立するための狭い時間枠は、新生児の腸ニッチ内に発達的に制限された寛容原性 APC が存在することを示唆しています。

胸腺外 pTreg 細胞は、オーファン核内受容体 RORγt の発現によって胸腺の対応する細胞と区別され、共生細菌抗原に応答して腸間膜リンパ節 (mLN) で発生し、腸内細菌に対する炎症性免疫応答の抑制に重要な役割を果たします 6,11。逆に、RORγt+ 細胞による MHCII 制限抗原提示が欠損したマウス (MHCIIΔRORγt) は、共生細菌に対する耐性を確立していないため、重度の腸炎症を発症します 12 。このことは、RORγt+ APC と RORγt+ pTreg 細胞生成との間に潜在的な関連性があることを示唆しています。この可能性に対処するために、pTreg 細胞が腸に蓄積する生後 3 週目の MHCIIΔRORγt マウスを分析しました 5,6。 CD44hi Tエフェクター（Teff）細胞の増殖とともに、mLNおよび結腸固有層内のRORγt + pTreg細胞の顕著な減少が観察されました（図1a〜dおよび拡張データ図1a）。 8週齢で、これらのマウスは、結腸ヘルパー17（TH17）細胞の増殖とともにRORγt + pTreg細胞の持続的かつ重度の減少を示しました（図1eおよび拡張データ図1b）。これは、顕著な効果を実証した以前の研究と一致しています。炎症性TH17細胞の抑制における病原菌特異的RORγt+ pTreg細胞の役割11。組織学的分析により、顕著な炎症性細胞浸潤、粘膜潰瘍形成および陰窩の喪失を伴う重度の大腸炎が実証され（図1f、g）、調節不全の腸管免疫応答の予防におけるRORγt + APCの重要な役割が確認されました。

1.5, adjusted P < 0.01) for each Thetis cell cluster. h, Dot plot showing expression of selected cell-surface markers that are differentially expressed between Thetis cell subsets. i, Gating strategy for identification of Thetis cell subsets. j, Intracellular expression of AIRE protein by Thetis cell subsets; each symbol represents an individual mouse (n = 4). k, summary of TC I–TC IV phenotypes. Plots in i are representative of n = 6 mice from 3 independent experiments. Data in b,e,j are representative of 3 independent experiments. Box plots in c indicate median (centre line) and interquartile range (hinges), whiskers represent minimum and maximum values, and dots represent outliers./p>

50,000 cells (viability 95%) were lysed for 4 min and resuspended in Diluted Nuclei Buffer (10x Genomics, 2000207). Lysis efficiency and nuclei concentration was evaluated on Countess II automatic cell counter by trypan blue staining. Nuclei (9,660 per transposition reaction) were loaded, targeting recovery of 6,000 nuclei after encapsulation. After the transposition reaction, nuclei were encapsulated and barcoded. Next-generation sequencing libraries were constructed following the manufacturer’s instructions, and were sequenced on an Illumina NovaSeq 6000 system./p>

1,000 and < 50,000), the number of detected genes (>500 and < 6,000), and the fraction of mitochondrial transcripts (<15%). Barcodes were further filtered based on the number of scATAC-seq fragments (3.5 < log10(number of fragments) < 4.5) and transcription start site enrichment score (>4). Arrow files were created from the scATAC-seq fragments using ArchR v1.0.154, and doublets were identified and removed with default parameters. Finally, any genes detected in <2 cells in the scRNA-seq data were discarded, leaving 20,779 genes. After clustering, the scRNA-seq data (described in ‘Dimensionality reduction, cell clustering, and visualization’), and based on the expression of marker genes, we identified 5 minor contaminant clusters (glial cells; cluster 17, plasmacytoid dendritic cell; cluster 18, Rorc–/lo CCR7+ dendritic or Thetis cell; cluster 19, mixed monocyte/cDC1; cluster 20, and macrophage; cluster 21) which were excluded from downstream analyses. In total, 10,145 cells remained, with a median scRNA-seq library size of 3,150 and a median of 13,885 scATAC-seq fragments./p>50,000), number of detected genes (>1,300), and the fraction of mitochondrial transcripts (<8%). Finally, genes detected in <2 cells were discarded. A total of 481 cells remained, with a median library size of 924,319 from 27,195 genes./p>1.5) and adjusted P value (<0.01). Ribosomal and mitochondrial genes were removed from the final list of genes reported or visualized. Where stated, the top DEG markers were subsequently selected for each group, based on fold change./p>

1.3, adjusted P < 0.01) comparing the scRNA-seq clusters in a one-vs-rest test, that were also expressed in the microarray data. The proliferating and progenitor clusters were excluded from the differential expression test, and the LTi clusters were grouped together. For visualization of results, only cell lineages containing a cell type with > 0.25 cosine similarity with either Thetis cell or ILC3 clusters were plotted./p>

1.3, adjusted P < 0.01) identified in a one-vs-rest differential expression test for non-proliferating Thetis cell clusters (2–5), that were also expressed in the thymic epithelial cells. Among individual clusters of thymic epithelial cells defined in the original dataset, we identified 2 clusters of transit amplifying AIRE+ cells (clusters 25 and 26), distinguished by signature gene expression including cell cycle genes./p> 1.5, adjusted P < 0.01), we identified orthologous human genes that were uniquely mapped by gprofiler2 and computed enrichment scores for Thetis cell subset gene signatures for each human cell./p>0.001 of the sequence) were filtered. Regions from all groups were compiled and overlapping regions were merged to their union, resulting in a non-overlapping set of 176,942 peaks. A peak-by-cell count matrix was created by ArchR with a ‘ceiling’ value of 4 for the counts to avoid strong biases./p> 1 h at room temperature, postfixed in 1% osmium tetroxide, dehydrated in acetone, and processed for Epon embedding. Ultrathin sections (60–65 nm) were counterstained with uranyl acetate and lead citrate. Images were taken with a transmission electron microscope (Tecnai G2–12; FEI) equipped with a digital camera (AMT BioSprint29)./p>

1.5, P < 0.01). d, Expression score of cell-cycle genes for each scRNA-seq cluster. e, Dot plot showing expression of myeloid genes. f, Flow cytometry of Zbtb46 (GFP) expression in ILC3 subsets from mLN of 3-week-old Zbtb46GFPRorgtcreR26lsl-tdTomato mice. Representative of n = 4 mice from two independent experiments. g-h, CellTypist derived cell labels for cell clusters from Fig. 2g, using a broad classification (g) or finer cell type annotation (h). i, Correspondence between cell labels for scATAC-seq and scRNA-seq./p>

1.5, adj. P < 0.01) between Aire+ mTEC and TC I. i, Bar graph showing log-normalized expression of Ptprc and Rorc genes in Aire+ mTECs and TCs. j, Flow cytometry of RORγt expression in Aire+ mTECs isolated from P18 RorcVenus-creERT2AireGFP mice. k, Heatmap reporting scaled expression values for top differentially expressed genes (FC > 1.5, adj. P < 0.01) between indicated SS2 clusters (f). Data in a,b are representative of > 3 independent experiments. Data in j representative of n = 5 mice from two independent experiments./p>